1、第 51 卷 第 4 期 2 0 1 5 年 4 月 林 业 科 学 SCIENTIA SILVAE SINICAE Vol. 51 ， No. 4 Apr ， 2 0 1 5 doi: 1011707/j1001-748820150415 收 稿日期 :2013 04 09 ;修回日期 :2015 01 12 。 基金项目 :林业 公 益 性行 业科 研 专项 “ 重大 森 林 病虫 灾 害 防 控 技 术 的 关 键 理论 基 础 ” ( 201204501 );国 家 “ 十 二 五 ” 科技 支 撑 项目 “ 商 品 林 重大 病虫 害 监 测 预 警 与 防 控 技 术 研究 示 范
2、 ” ( 2012BAD19B08 )。 *梁 军 为 通讯作者 。 土 壤 中 杨 树 溃 疡 病 生 防 菌 的分 离 鉴 定 * 杨 蕾 2， 3 梁 军 1， 3 周 国 英 2 倪 杨 3 吕 全 3 张 星 耀 1， 3 ( 1 南 京 林 业大学 南 方现 代 林业 协 同 创 新 中 心 南 京 210037 ;2 中 南 林业科技大学林学院 长 沙 410004 ; 3 国家林业 局 森 林 保护 重 点 试 验室 中国林业科学 研究 院 森 林生态环境与 保护 研究所 北 京 100091 ) 摘 要 : 【 目 的 】 杨 树 溃疡 病 是 中国 杨 树 人工林重大生物
3、灾 害 之一 ， 采用 生物 防 治 的 方法 控 制 杨 树 溃疡 病 是持 续 有 效 的 手 段 。 本研究 旨 在 从 杨 树 林 地 土 壤 中分 离 出 对杨 树 溃疡 病 菌 有 良 好 生 防 效果 的 拮 抗 微 生物 。 【 方法 】 以杨 树 溃 疡 病病 原 菌 葡萄 座腔 菌 为 靶 标 ， 进行 土 壤 中生 防 微 生物的分 离 、 筛 选 和 鉴 定 。 土 壤 微 生物的分 离 采用 稀 释 平 板 涂 布 法 ;拮 抗 微 生物的 筛 选 分为 初 筛 、 发 酵 液 复 筛 和 拮 抗 菌 株 离 体 复 筛 3 步 ， 初 筛 采用平 板 对 峙 法 ，
4、 拮 抗 菌 发 酵 液 复 筛 选 择 三 明 治 法 和 改良琼 脂 扩散 法 相 结 合 的 方法 ， 最 终 通 过 离 体 组 织 防 治 效果测 定确定 目的生 防 菌 株 ;生 防 菌 株 的 鉴 定 采用 形 态学 观察 和分 子 生物学 鉴 定 相 结 合 的 方法 。 【 结果 】 在 河 北 省 廊坊 市 和 河 南 省 原 阳县 的 杨 树 林 地 中 按 上 、 中 、 下 3 层 共 采 集 48 份 土 样 ， 从 土 样 中 共 分 离 得到微 生物 259 株 ， 其中 细 菌 122 株 ;放 线 菌 106 株 ;真菌 31 株 ， 各 土 层 微 生 物
5、 数 量规律 整 体 符 合上 层 中 层 下 层 ;通 过 平 板 对 峙 法 初 筛 选择 出 8 株 抑菌 带 直径 4 mm 的 细 菌 和 放 线 菌 以 及 8 株 拮 抗 菌菌 落 直径 40 mm 的 真菌 ;再 通 过发 酵 液三 明 治 法 和 改良琼 脂 扩散 法 复 筛 ， 筛 选 出 8 株 对杨 树 溃疡 病 有 良 好 抑 制 作 用 的 拮 抗 菌 ， 分 别 是 细 菌 TYZ1B3 和 YX5B1 ， 真菌 LS10F1 ， LX5F1 ， LZ10F1 ， LS6F1 ， LX6F2 和 TLZ2F2;最 终 通 过 离 体 组 织 防 治 效果测 定 ，
6、 从 这 8 株 拮 抗 菌 株 中 筛 选 出 1 株 土 壤 生 防 真菌 LX6F2 ， 其 对杨 树 离 体 组 织 溃疡 病 的 防 治 效 果 可 达 76.04% ;经过 形 态学 观察 ， 菌 株 LX6F2 的 菌 落 、 菌 丝 及 孢 子形 态 符 合 镰 刀 菌 的 特征 ， 通 过 rDNA-ITS 序 列 及其 系统发 育分 析 ， 测 得 生 防 菌 株 LX6F2 的 序 列 长 度为 563 bp ， 序 列 登 录 号 为 F872729.1 ， 其与 编 号 为 JN038467 的 木 贼 镰 刀 菌 相 似 度高 达 100% ， 从 而 鉴 定 该
7、菌 株 为 木 贼 镰 刀 菌 。 【 结 论 】 该 菌 株 的 发 现 为 杨 树 溃疡 病 的生物 防 治 提供 了 新 的原 材 料 ， 对杨 树 溃疡 病 的 可 持 续 控 制 具有 重 要 意义 ， 可 在 后 续 研究 中 将 进 一 步 对 其 抑菌 机 理 、 有 效 拮 抗 成 分及 菌 剂 研 制 等 进行 研究 。 关键词 : 土 壤 微 生物 ;杨 树 溃疡 病 ;木 贼 镰 刀 菌 ;拮 抗 活 性 ;生 防 菌 株 中图分类号 :S761. 3 文献标识码 :A 文章编号 :1001 7488 ( 2015 ) 04 0116 10 Isolation and
8、Identification of Bio-control Microorganisms in Soil to Poplar Canker Yang Lei 2， 3 Liang Jun 1， 3 Zhou Guoying 2 Ni Yang 3 L Quan 3 Zhang Xingyao 1， 3 ( 1 Southern modern forestry cooperative innovation center ， Nanjing Forestry University Nanjing 210037 ; 2 College of Forestry ， Central South Univ
9、ersity of Forestry Technology Changsha 410004 ; 3 The Key Laboratory of Forest Protection of China State Forestry Administration ， esearch Institute of Forest Ecology ， Environment and Protection ， Chinese Academy of Forestry Beijing 100091 ， China ) Abstract : 【 Objective 】 Poplar canker is one of
10、the major biological disasters of poplar plantations in China The biological control method for regulating poplar canker is sustained and effective The aim of this study is to find and isolate antagonistic microorganisms which have good bio-control effect on poplar canker from the poplar forest soil
11、 【 Method】 In this study ， poplar canker pathogen Botryosphaeria dothidia was used as the target strain ， and the bio-control microorganisms in the soil were isolated ， screened and identified The dilution plate coating method was used to separate soil microorganisms Three procedures were applied to
12、 screen the antagonistic microbes ， including primary screening ， fermentation liquor secondary screening and the inhibitory action in vitro The dual culture method was used in primary screening ， the“ sandwich method ” and the“ improved agar diffusion method ” were combined in fermentation liquor s
13、econdary screening ， and the objective bio-control strain was used ultimately to determine the control effect on poplar canker in vitro tissue The bio-control strain was identified by combining morphological observation and the the molecular biology method 【 esult】 Totally 48 soil samples were colle
14、cted in upper ，第 4 期 杨 蕾 等 :土 壤 中 杨 树 溃 疡 病 生 防 菌 的分 离 鉴 定 middle and deeper soil layers of poplar forest in Langfang Hebei and Yuanyang Henan A total of 259 strains were isolated in the 48 soil samples ， including 122 bacteria strains ， 106 actinomycetes strains and 31 fungi strains The microbial d
15、istribution pattern overall followed as :top layer soil middle layer soil lower layer soil There were 8 bacteria and actinomycetes strains ， screened in primary screening ， which had antibiological average diameters 4 mm ， and there were 8 fungi strains ， selected by dual culture ， which had colony
16、diameter 40 mm Eight antagonistic microorganisms strains were selected by fermentation medium secondary screening They were bacteria strains of TYZ1B3 and YX5B1 ， and fungi strains of LS10F1 ， LX5F1 ， LZ10F1 ， LS6F1， LX6F2 and TLZ2F2 ， respectively Through determination of the control effect in vitr
17、o tissue ， a bio-control fungus strain ， LX6F2 ， was obtained ， and the control effect of the strain could be up to 7604% The LX6F2 feature ， including the colonies ， hyphae and spores ， was matched withFusarium sp by morphological observation Through rDNA ITS sequence and phylogenetic analysis ， th
18、e LX6F2 sequence length was 563 bp ， and the sequence registration number was F8727291 There was 100% similarity between LX6F2 rDNA ITS sequence and the Fusarium sp strain s sequence which number is JN038467 in GenBank Based on these results ， the strain LX6F2 was identified as Fusarium equiseti 【 C
19、onclusion 】 The discovery of LX6F2 provides a new raw material for biological control of poplar canker It s important for sustainable control of poplar canker In a follow-up study its antibacterial mechanism ， effective antagonist compositions ， bacterium agent and so on will be investigated Key wor
20、ds : soil antagonistic microorganisms ;poplar canker ;Fusarium equiseti ;antagonistic activity ;bio-control strain 杨 树 溃 疡 病 有 性型 病 原 菌 ( Botryosphaeria dothidia )， 无 性 型 聚 生 小 穴 壳 菌 ( Dothiorella grearia ) 是 中国 杨 树 ( Populus )干 部 病 害 中的 主要 类 型 ， 在 中 国华北 、 西北及 南 方杨 树 栽 培 区 均 有 分 布 ， 在 杨 树 幼 林 上发 生 较
21、多 ， 危 害 严 重 ， 一 般 在 感 病 品 种上发 病 率 高 达 80% 100% ， 死 亡 率 达 30% 50% (向 玉 英 等 ， 1996 )。 该 病 是 中 国 杨 树 人工林重大生物 灾 害 之一 ， 是一种 寄 主主 导 型 病 害 ， 其 发 生与 寄 主 的 树 势 强 弱 、 健 康 状 况 密 切相 关 ， 严 重 制 约 了 杨 树 人工林的 发 展 (张 星 耀 等 ， 2003 ;梁 军 等 ， 2005 ;焦 一 杰 等 ， 2010 )。 研 究表 明 ， 寄 主体 内微 生物的 种群 和 数 量 对 于 病 害 的 发 生 有 着 密 切 的
22、关系 ， 噬 菌 体 ( Phage )对 柑橘溃疡 病 ( Xanthomonas ampestris )和 柑橘 细 菌 性 病 害 有 良 好 的 抑 制 作 用 (Baloghet al， 2008 )， Anand等 用 荧 光 假 单 胞 菌 ( Pseudomonas fluorescens ) 和 化 学 杀 菌 剂 联 合 作 用 控 制 了 辣 椒 根 腐 病 ( Colletotrichum apsici )和 粉 霉病 ( Leveillula taurica ) 的 发 生 ， 任 嘉 红 等 ( 2010 )发 现 吡 咯伯 克 霍 尔 德 氏 菌 ( Burkho
23、lderia pyrrocinia ) JK-SH007产 生的 抗 菌蛋 白 可 很 好 地 抑 制 杨 树 溃疡 病 菌 的生 长 。 杨 树 溃疡 病 有 多种 类 型 ， 分 别 由 葡萄 座腔 菌 属 ( Botryosphaeria )、 疡 壳 孢 属 ( Dothichiza )、 盾囊 霉 属 ( Coniothyrium )、 腐 皮 壳 属 (Valsa )、 棒 盘 孢 属 (Coryneum )、 从 赤 壳 属 ( Nectria )、 茎 点 霉 属 ( Phoma )等 真菌 引 起 (任 飞 娟 等 ， 2011 )， 其 中 病 原 菌 葡萄 座腔 菌 的
24、寄 主种 类 最 多 ， 分 布 地 域 最 广 ， 侵染 能力最 强 ， 为 害 较 为 严 重 。 目 前 对杨 树 溃疡 病 的 防 治 主要 通 过 调 整 杨 树 林生态 系统 空间 结 构 及物 理 和 化 学 方法 完 成 (洪 少 明 ， 2011 )。 但 生 态 系统 空间 结 构 调 控 是一 个 相 对 较 长 的 过程 而 化 学 防 治 对于 环境的 污染 和 破 坏 已 成 为 不 容 忽 视 的 问题 。 在 人 们 愈 来 愈 关 注 环境 安 全 的 情 况 下 ， 对杨 树 溃疡 病 的 防 治 也 提 出了 越来越 高的 安 全 要 求 。 随着 社会
25、经 济 的 发 展 和人 们 环境 保护 意 识 的 增 强 以 及生物 防 治 技 术 的 愈 加 成 熟 ， 用 生物 防 治 的 方法 治 理 杨 树 溃疡 病 极 有 可 能成 为 取代 化 学 防 治 的 有 效方法 。 本研究 旨 在 筛 选 具有 开 发 潜 力 的 优 良 生 防 菌 株 ， 为 杨 树 溃疡 病 的生物 防 治 奠 定 基 础 。 1 材 料 与 方 法 1.1 采 样 点 基本 情 况 1. 1. 1 河 北 廊坊 造 林 地 位 于 廊坊 广 阳 区 ， 为 冲 积 平 原 ， 气候 条 件 基 本 一 致 ， 年 均 温 度 11. 8 ， 年 均降 水
26、 量 593. 4 mm ， 年 均 日 照 时间 2 689 h ， 无 霜 期 183 天 ， 海拔 10. 0 13. 8 m ， 地 下 水 位 3 5 m 。 影响 立 地 条 件 的 主要 因 子 为土 壤 差异 和 水 分 供 应 情 况 。 本 实验 基 地 的 杨 树 品 种 为 欧美 杨 107 杨 ( Populus euramericana Neva)(简 称 107 杨 )、 欧 美 杨 108 杨 ( P euramericana Guariento )(简 称 108 杨 )和 毛 白 杨 ( P tomentosa )，栽 种 模 式 为 各 无 性 系 块 状
27、 混 交 ， 品 种 构 成 上 107 杨 占 35% ， 108 杨 占 31% ， 毛白 杨 占 34% 。 株行距 为 ( 3 m 4 m )6 m 。 平均 树 高 9. 82 m， 胸径 10. 32 cm ， 冠 幅 0. 87 m。 1. 1. 2 河 南 原 阳 位 于 原 阳县 蒋 庄 乡 靳屋 村 北 ， 面 积 约 53. 33 hm 2 ， 属 黄 河 冲 击 平 原 ， 属 暖 温 带 大 陆 性 季 风 气候 ， 年 平均 气 温 13. 4 ， 年 均 湿 度 68% ， 年 平 均降 雨 656. 3 mm ， 无 霜 期 220 天 ， 全 年日 照 时间
28、约 2 400 h ， 土 地 肥 沃 、 光 热 充 沛 ， 地 下 水 源 富 足 。 本 试 验 基 地 的 杨 树 品 种 为中林 46 (P euramricana 7 1 1林 业 科 学 51 卷 Zhonglin46 )和 毛 白 杨 无 性 系 块 状 混 交 ， 品 种 构 成 上 中林 46 占 43% ， 毛白 杨 占 57% 。 株行距 为 ( 2. 5 m 3 m ) 4 m 。 平均 树 高 8. 63 m， 胸径 9. 78 cm， 冠 幅 0. 77 m。 1.2 试验材料 1. 2. 1 培 养 基 细 菌 分 离 选 用 NA 培 养 基 ， 配 方 为
29、:牛 肉 膏 5 g， 蛋 白 胨 10 g， 蔗 糖 10 g， 琼 脂 15 20 g， H 2 O 1 000 mL ， pH7. 2 7. 4;放 线 菌 的 分 离 选 用 高 氏 1 号培 养 基 ， 配 方 为 :可 溶 性 淀粉 20 g， 氯 化 钠 0. 5 g， 硝 酸 钾 1 g， 硫 酸铁 0. 01 g， 磷 酸 氢 二 钾 0. 5 g， 水 硫 酸 镁 0. 5 g， 琼 脂 20 g， 水 1 000 mL ， pH7. 2 7. 4;真菌 分 离培 养 采用 PDA 培 养 基 ， 配 方 为 :去 皮 马 铃薯 200 g， 葡萄糖 20 g， 琼 脂 1
30、5 20 g ， 水 1 000 mL ， pH值 自 然 。 1. 2. 2 供 试 病 原 菌 葡萄 座腔 菌 ( Botryosphaeria dothidica)由 中国林业科学 研究 院 森 林 保护 实验室 菌 种保 藏 中 心 提供 ， 编 号 为 72 B。 1. 2. 3 杨 树 扦 插 苗 离 体 组 织 试 验 中 选 用 的 杨 树 扦 插 苗 为 毛白 杨 当 年生 苗 木 。 在 温 室 内 采用枝 接 顶 端 封 蜡 的 方法 进行 扦 插 ， 扦 插 时间 为 当 年 3 月 ， 使 用 时间 为 当 年 8 月 。 使 用 时苗 高 90 120 cm ， 主
31、 干枝 条 直径 为 5 10 mm 。 扦 插 苗 生 长 状 况 良 好 ， 无 病 虫 害 。 1.3 试验方法 1. 3. 1 土 样采 集 在 廊坊 和原 阳县各 选择 2块 样 地 ， 在 每 个 样地根据杨 树树 势 生 长 情 况 、 病虫 害 是 否 发 生 以 及土 壤 及林 下 植被 情 况选择 采样点 ， 其中 廊 坊 11 个 ， 原 阳 5个 ， 共 16 个 采样点 。 采 土 样 时 ， 按 照 不同 土 层 分 别采 集 距 杨 树主 干 20 cm 范 围 内 的土 样 ， 去 除 土 壤表层 杂 物 后 ， 上 层 ( S)土 壤 为 5 15. 99 c
32、m ， 中 层 ( Z)为 16 25. 99 cm ， 下 层 ( X)为 26 40 cm 。 采 集 采样点各层 土 壤 50 g， 共 48 份 ， 装 入 塑 封袋 内 。 记录 采 集 人 姓 名 ， 采 集 时间 ， 地点 ， 立 地 条 件 ， 海拔 、 地 形 、 气候 及 植被 、 土 壤 类 型 、 寄 主 及 其 附 近 植 物 、 种 类 及生 长 情 况 、 发 育 阶 段 等 。 采 集 的 土 壤 置 于 4 冰箱内 保 存 ， 并 尽 快 分 离 。 1. 3. 2 土 壤 微 生物的分 离培 养 采用 稀 释 平 板 涂 布 法 分 离 土 壤 微 生物 。
33、 将 1 g土 壤 置 于 装 有 100 mL 无 菌 水 的 250 mL 三 角 瓶 中 制 成 土 壤 悬 浮 液 母 液 。 将母 液 置 于 28 摇床 中 震荡 1 h。 无 菌 条 件 下 对 土 壤 母 液 进行 10 倍 梯 度 稀 释 ， 稀 释倍 数 为 10 2 10 7 ， 细 菌 选 用 10 5 10 7 稀 释 梯 度 的土 壤 悬 浊 液 进行 分 离 ， 放 线 菌 选 用 10 3 10 5 稀 释 梯 度 的土 壤 悬 浊 液 进行 分 离 ， 真菌 选 用 10 2 10 4 稀 释 梯 度 的 土 壤 悬 浊 液 进行 分 离 。 用 无 菌 移液
34、 枪 吸 取 0. 1 mL 土 壤 悬 浊 液 涂 布 于 相应 的 平 板 培 养 基 上 ， 每 个 梯 度 设 3 个 重 复 ， 并将 上 述 平 板 培 养 基 放 入 培 养 箱 中 培 养 。 其中 ， 细 菌 培 养 温 度为 37 ， 真菌 和 放 线 菌 的 培 养 温 度为 28 。 NA 平 板 培 养 2天 后 ， 高 氏 1 号 和 PDA 平 板 培 养 4 天 后 进行 观察 计数 。 根据 菌 株 的 不同 形 态 特征 ， 将 培 养 分 离 的 不同 种 类微 生物 进 一 步 纯 化 ， 直至获得 纯 培 养 物 。 1. 3. 3 拮 抗 微 生物的
35、 初步 筛 选 选择 杨 树 溃疡 病 病 原 菌 葡萄 座腔 菌 为 指 示 菌 株 ， 提 前 7天 将 病 原 菌 活 化 待 用 。 拮 抗 能力 的 测 定选择 平 板 对 峙 法 :1)拮 抗 细 菌 和 放 线 菌 :在 PDA 平 板 中 央 接 入 直径 为 5 mm的 已 活 化 5天 的 病 原 菌菌 块 ， 然 后 在 距 培 养 皿 边缘 2 cm 的 同 心 圆 上 每相 距 120 的 培 养 基 上 用 接 种 针 接 入 分 离 的 菌 株 ， 28 下 培 养 3 天 后 ， 测 得 其 抑菌 圈 大 小 。 每 个 菌 株 在一 个 培 养 皿 内 接 3
36、 个 点 并 重 复 3 次 。 2)拮 抗 真菌 :分 别 取 5 mm 的 活 化 5天 后 的 病 原 菌 与土 壤 真菌菌 饼 ， 接 种 于 PDA 平 板 培 养 基中 线距 边缘 1 cm 处 ， 每 个 土 壤 真菌 重 复 3 次 ， 置 于 28 下 ， 黑 暗 恒 温 培 养 3 天 ， 每 天 记录 相 对 横 向 生 长长 度 ， 并 拍 照 。 此 方法 中 ， 病 原 菌 和土 壤 真菌 在 同 一 培 养 皿 内 生 长 ， 会 竞争培 养 基中的 营 养 、 生 存 空 间 等 ， 即 此 方法 主要 判 定 土 壤 真菌 对 病 原 菌 的 竞争 作 用 强
37、 弱 。 在 本 文中 将 对 峙 试 验 中的 竞争 作 用根据 郭 润 芳 等 ( 2002 )的 方法 进行 修 正 ， 按 以 下标准进行 等 级 分 类 : :土 壤 真菌菌 落 直径 占 据平 板 100% ; :土 壤 真菌菌 落 直径 占 据平 板 2/3 ; :土 壤 真菌菌 落 直径 占 据平 板 2/3 但 l/3; :土 壤 真菌菌 落 直径 占 据平 板 l/3; :病 原 菌菌 落 直径 占 据平 板 100% 。 1. 3. 4 拮 抗 微 生物的 发 酵 液 复 筛 发 酵 培 养 液 的 制 备 :将 初 筛 的 拮 抗 菌 株 分 别 在 NA 或 PDA
38、培 养 基 上 活 化 。 细 菌 用 接 菌 环 移 取 一 环 置 入 装 有 100 mL NA 液 体 培 养 基的 250 mL 三 角 瓶 中 ， 在 35 、 120 r min 1 的 摇 床 上 振 荡 培 养 48 h， 拮 抗放 线 菌 和 真菌 用 打 孔 器 取 4 mm 的 菌 饼 ， 接 入 PDA 培 养 基中 ， 28 、 140 r min 1 的 摇 床 上 振 荡 培 养 96 h。 采用 2 种 方法 进行 发 酵 液 复 筛 ， 用 “ 三 明 治 法 ” 来 判 定 拮 抗 菌 株 发 酵 液 难 挥发 物 质 的 拮 抗 活 性强 弱 ， 用 改
39、良 的 琼 脂 扩散 法 来 衡 量 接 抗 菌 易 挥发 扩散 物 质 的 抗 菌 物 质活 性 高 低 。 经 初 筛 选 出 的 拮 抗 菌 都 需 分 别 进行 这 2种 方法 的 复 筛 。 1)三 明 治 法 (邱 思 鑫 ， 2004 ):在 直 径 9 cm 的 培 养 皿 中 倒 入约 3 mL PDA 培 养 基 ， 凝 固 后 加 入 1 mL 分 离 菌 株 的 培 养 液 和 3 mL 冷 却 至 45 左右 8 1 1第 4 期 杨 蕾 等 :土 壤 中 杨 树 溃 疡 病 生 防 菌 的分 离 鉴 定 的 PDA 培 养 基 ， 摇 匀 凝 固 后 再 加 入 约
40、 15 mL PDA 培 养 基 (要 求倒 好 的 平 板 表 面 不长 细 菌 )， 以 加 1 mL 无 菌 水 和 3 mL PDA 为 对 照 ， 然 后 在 平 板 上 接 入 直径 为 5 mm 的 病 原 菌菌 饼 ， 28 黑 暗 培 养 5天 后 用 十 字 交 叉 法测 量 病 菌菌 落 直径 ， 计算 抑 制 率 。 按 以 下 公 式 计算 抑 制 率 。 选 出 抑菌 效果 最 好 的 菌 株 ， 保 存 备 用 。 抑菌 率 ( % )= 对 照 菌 落 直径 处 理 菌 落 直径 对 照 菌 落 直 径 100% 。 2)改良 的 琼 脂 扩散 法 :在 凝 固
41、 的 PDA 琼 脂 平 板 距 边缘 1. 5 cm 处 的 圆 周 上等 距 离 打 3 个 孔 ， 孔 洞 直径 为 4 mm ;将 预 先 培 养 好 的 病 原 菌 用 打 孔 器 取 4 mm 的 菌 饼 接 在 培 养 皿 中 央 ， 再 将 液 体 培 养 4 天 的 拮 抗 菌 的 上 清 液 20 L 滴 加 到 各 孔 中 ， 28 恒 温 培 养 ， 4 天 后 观察 记录 。 以 在 孔 洞 中 加 入 20 L无 菌 水 作为 对 照 。 所 有 处 理 进行 3 次 重 复试 验 。 1. 3. 5 拮 抗 菌 的 离 体 复 筛 1)杨 树 溃疡 病 菌 孢 子
42、 液 的 制 备 杨 树 溃疡 病 菌 在 PDA 平 板 上 28 培 养 ， 待 充 分 产 孢 后 ， 加 无 菌 1% 葡萄糖 溶液 10 mL 浸 15 min， 用 无 菌 的 棉 签洗 下 孢 子 和 菌 丝 体 ， 经 无 菌 脱 脂 棉 过 滤 ， 除 去 菌 丝 体 ， 再 用 无 菌 1% 葡萄糖 溶液 配 成 悬 浮 液 ， 将 孢 子 含 量 调 到 10 10 倍 视 野 含 80 100 个 孢 子 。 2)拮 抗 菌 发 酵 液 的 制 备 用 250 mL 的 三 角 瓶 装 入 100 mL 培 养 液 ( pH7. 0)， 细 菌 用 NA 培 养 基 ，
43、 真 菌 和 放 线 菌 用 PDA 培 养 基 ;灭 菌 冷 却 后 ， 接 种 10 mL 活 化 的 拮 抗 菌菌 液 ;细 菌 35 120 r min 1 振 荡 培 养 48 h， 放 线 菌 和 真 菌 28 ， 140 r min 1 振 荡 培 养 96 h。 3)试 验 方法 选 取 生 长 一 致 的 当 年生 杨 树 扦 插 苗 ， 截取 约 7 cm 长 的 干 部 枝 条放 入 直径 为 9 cm 的 培 养 皿 内 ， 皿 底 铺 上一 层 约 2 mm 厚 的 脱 脂 棉 并 加 入 少 量 无 菌 水保 湿 培 养 。 每 个 培 养 皿 中 放 置 3 根枝
44、 条 ， 每 个 处 理 分 别设 3 次 重 复 ， 即 每 个 生 防 菌 株 处 理 9 根枝 条 。 用 已 灭 菌 的 接 种 针 沾 取 拮 抗 菌 发 酵 液 在 枝 条 上 进行 刺 伤 接 种 ， 蘸 取 的 发 酵 液 量 以不 从 接 种 针 上 滴 下 为 宜 ， 刺 伤 接 种 的 伤口 大 小 约 1 mm 。 将 蘸 有 预 先 制 好 的 病 原 菌 孢 子悬 浮 液 的 脱 脂 棉 覆 盖 在 刺 伤 接 种 的 伤口 上 ， 清 水 对 照 ， 28 保 湿 培 养 ， 10 天 后 待 对 照 枝干 充 分 发 病 后 ， 进行 病 情 调查 并 计算 病
45、 情 指 数 和 防 治 效果 。 室 内 离 体 组 织 试 验 病 级 分 类按 表 1 标准进行 。 病 情 指 数 = (病 级 枝数 该 病 级 代 表数 值 ) 调查枝数 发 病 最 高 一 级 代 表 值 100 。 防 治 效 果 ( % )= 对 照 组 平均 病 情 指 数 处 理 组 平均 病 情 指 数 对 照 组 平 均 病 情 指 数 100% 。 综合 初 筛 、 复 筛 及 离 体 复 筛 的 结果 ， 筛 选 出 拮 抗 效果 强 的 菌 株 作为目的 菌 株进行下 步 试 验 。 表 1 室 内接 种 病斑 分 级 标 准 Tab.1 Disease gra
46、dings standards of indoor inoculation experiment 病 斑 直 径 Scab diameter/mm 分 级 Grading 代 表 值 Central value 0 0 0 1. 00 5. 99 1 6. 00 10. 99 2 11. 00 15. 99 3 16. 00 19. 99 4 20. 00 5 1. 3. 6 拮 抗 菌 株 的 鉴 定 1)形 态 培 养 特 征 观察 使 用 PDA 固体 培 养 基和 插 片接 种 法 接 种 ， 于 28 下 培 养 ， 分 别于 7， 15， 30 天 后将盖 玻片 取 出 ， 在 显
47、 微 镜 下 观察 基 内 菌 丝 、 气 生 菌 丝 形 态 以 及 孢 子 丝 的 形 态 特征 。 2)rDNA-ITS PC 纯 化 扩 增 和 序 列 测 定 对 拮 抗 菌 依据 核 糖 体 基 因内 转 录间 隔 区 ( rDNA-ITS)序 列 进行 分 子 鉴 定 。 以 真菌 rDNA-ITS 序 列 的通 用 引 物 ITS1( 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 )和 ITS4( 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 )对 菌 株 的基 因组 DNA 进行 PC 扩 增 。 扩 增 体系 :2 Pfu PC Mix 25 L， 上 游引 物 (
48、10 mol) 2 L， 下 游引 物 ( 10 mol) 2 L， 基 因组 模 板 1 L， 总体积 为 50 L;扩 增 程 序 : 95 预 变 性 3 min， 95 变 性 30 s， 55 退 火 30 s， 72 延 伸 60 s， 共 35 个 循 环 ， 最 后 72 延 伸 8 min。 取 3 L PC 产 物 经过 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 ， 以 DNA Marker DL2000 为 分 子 量 标准 ， 电 泳 结 束 后 ， 拍 照 记录 电 泳 结果 。 序 列 经 BioEdit等 软件 分 析 和 手 工 校 正 后 ， 用 NCBI
49、 的 BLAST( 2. 2. 12version )程 序 将 测 出 的 序 列 与 在 GenBank(http: www ncbi nlm nih gov/ BLAST)中 已 知 菌 种 的 ITS序 列 进行 同 源 性 比较 分 析 ， 从 而 确定 菌 株 的分 类 地 位 。 2 结 果 与分 析 2.1 不 同 层 次 间土壤 微 生物的 变化 规律 根据 培 养 特 性 和 菌 落特征 判 定 ， 从 上 、 中 、 下 3 层 土 壤 中 共 分 离 得到 菌 株 259 株 ， 其中 细 菌 122 株 ， 放 线 菌 106 株 ， 真菌 31 株 。 各 土 层
50、微 生物 种 类 分 布 情 况 见 表 2。 细 菌 在 分 离 出 的 菌 株 中 占有 优 势 ， 其 9 1 1林 业 科 学 51 卷 次 是 放 线 菌 ， 而 真 菌 的 数 量 最 少 。 这 与土 壤 中 微 生 物的分 布 规律 相 符 。 在 下 层 土 壤 中 ， 3 类微 生物的 数 量 差 别不 大 。 2.2 杨 树 溃疡病 土壤 拮抗 菌 的 初 筛 通 过 平 板 对 峙 试 验 ， 从 259 株 菌 中 共 分 离 得 到 有 抑菌 效果 的 菌 株 69 株 ， 其中 细 菌 和 放 线 菌 36 株 ， 真菌 33 株 。 各 菌 株 拮 抗 作 用
