1apob的基础理论与临床应用价值

1、1.Apo B 的基础理论与临床应用价值 载脂蛋 白 B(apolipoprotein B)是 LDL 颗 粒 中惟一的蛋白质成分。在正常血浆中存在两种 apoB， 即 apoBl 00和 apoB48。apoBl 00 主要由 肝脏合成，在 VLDL 的组 装和分泌中起重要作用，它在血浆中的浓度为 6 O 1 20 mgdl。apoB4 8 主 要在小肠中合成，对乳糜微粒(CM)的组装 和分泌是不可缺少的。 因此， 对膳食中脂肪的吸收 apoB48 起着非 常重要的作用。 一、载脂 蛋 白 B的性质 apoB 的 最主要物理 化学特性是 不溶解于水 溶液，极易 发生自身的 聚合。在分 离过程

2、 中apoB 也容易 被蛋白酶水解和氧化。在 SDS-PAGE电泳中测定 apoBl 00 的分 子量为 5 4 9 kD，apoB48 的分 子量为 2 6 4 kD。 apoB 中 也含有碳水化合物，糖的含量约占 41 0。 apoB分子中有 1 9个潜在的 N一连接的糖基化位置， 还有 7 个 不 同区域可与肝素紧密结合。 这些结合区域除能促使富含三酰甘油的脂蛋白与毛细血管的内皮细胞结合之外， 它们还能促使脂蛋白脂肪酶水解脂蛋白( VLDL 和 CM)核心中的三酰甘油，使之 VLDL 形 成 IDL 和 LDL 。apoBl00 和 apoB4 8 均 有 高度的免疫原性，用它们免疫家兔

3、可形成多克隆抗体，这两种抗体之间具有交叉反应，表明这两种 apoB 含有共同的 抗原决定族。 在 apoB 的分子结构中含有 2 5 个半胱氨酸，它们在分子中的分布很不均一，其中 1 2个分布于前 500 个氨基酸 残基中。这 2 5 个半胱氨 酸中有 1 6个是以二硫键的形式存在。 apoB 以 两种形式存在，即 apoBl 00和 apoB48。在人体内，apoB48 产 生于小肠，apoBl 00 产生于肝 脏，小肠也可能产生一些 apoBl 00。apoB4 8 是 由 B1 00 的 氨末端的一半所组成， 含 2152个氨基酸残基， 不能与 LDL 受体的结 合域结合。 它 是乳糜微

4、粒和其残粒(remnant)的主要成分。 apoBl 00 含 4536 个 氨基酸残基， 是 VLDL 和 IDL 和脂蛋白 (a)Lp(a)的主要载脂蛋白，是 LDL 的惟 一载脂蛋白。 apoBl 00有两个区域相似于 apoE， 被用于与 LDL 受体相结 合， 其中从第 3 3 5 9到 3 3 6 7 位氨基酸残 基序列具有高度的保守性，带有很强的正电荷。这一区域既能调节 VLDL 与 LDL 受体的相 互作用，也能调节 LDL 受体的表达。用 apoBl 00 单 克隆抗体研究的结果证实，apoB 基 因 位点的突变大约使人群中 1020个体胆固醇水平受到明显影响。 但也有家族分

5、析资料表明， apoB 基 因位点不是影响血浆 apoB 水平的主要 位点，像家族性混合型高脂蛋白血症(FC H)或由于 LDL 引起的血脂异常都与 apoB 基因位点没 有关联。但是，如果含有脂蛋白脂肪酶 (LPL)、apoAIapoC apoA IV 基 因簇和 apoE 基因位点的变异，那么它们对群体中大部分个体的 apoB 水平都具 有一定的影响。apoBl 00 水 平的升高是几种疾病的主要特征， 如高 apoB 血症 (hyper-apoB-emia)、 FCH和致动脉粥样硬化脂蛋白表型。 高 apoB 血症 是早发性冠心病患者的一个共同的特征。 在这些患者中 apoB的水平相当于

6、家族性高胆固醇血症(F H)患者血浆中的水平， 但是 LDL c 水 平浓度则很低。 对血脂正常的个体和对高脂蛋白血症病人的大量分析结果表明， 在染色体中有一个特异的动脉粥样硬化敏感位点(atheroscleros is suspectibility locus， ATSL )控制着 LDL 颗粒的大 小 。该位点在第 1 9 号染色 体的短臂，接近 LDL 受 体位点和胰岛素受体基因位点。虽然具有胰岛素抗性的个体都具有致动脉粥样硬化的脂蛋白表型(AL P)，但是并不能完全肯定这个 ALP表型是由胰岛素受体基因变异造成的， 还是因为另一个更接近于 LDL 受 体的基因即 ATSL 位点的存在。

7、 二、载脂 蛋 白 B的物理 化学结构 、 性质及功 能 (一)apoB 的 物理化学结构 脱脂后的 apoB 在水容液 中容易聚集，不易溶解，对研究其结构带来不少困难，它既不溶于 42m olL 的四甲基 尿素(te tramethyl urea)，也不溶于水溶液的缓冲液。当用有机溶剂脱脂，它在 SDS 中是 以二聚体的形式存在。在分离过程中 apoB 易 于 被蛋白酶水解、氧化1或者机械地切变(shearing)。 Goto 等 曾用不同的化合物来修饰 apoB 并研 究其结构， 发现不同化合物对 apoB 的构象有 不同程度的影响，其影响程度是：羧丙酰基重 氮化酰基化 或氨基化。 化学修

8、饰也可能改变 apoB 的 抗原性， 但不影响其光学性质， 还原甲基化 apoB 中的赖氨酸和精氨酸可使其丧失与 LDL 受 体结合的能力， 说明 apoB 中赖氨酸和 精氨酸与 LDL 受体的结合密切相关。 apoB 的 分子量过去在不同实验室得到的结果差异很大， 过去 30 年中 研究者应用了不同的方法， 包括 X 射线散 射(scattering)、 电子显微镜、 溴化氰裂解、 凝胶过滤、 分析超速 离心和 SDS- 凝 胶电泳等，分子量从 8 kD5 5 kD。 这些差异主要是由于蛋白酶的分解、氧化剂的作用、 apoB 分子的聚 集等原因所致。 Kane 是 第一个报道 apoB 存在

9、亚类 ， 并 用 SDS-PAGE测定了 apoBl00和 apoB48的分子量，它们分别为 5 4 9 kD 和 26 4kD。 Yang 等 人以溴化氰完全裂解 apoBl 00的 C 一 末端片段，然后用(反相 )高效液相层 析纯化， 再以氨基酸分析仪定量测定其氨基酸， 按这种方法， 如果不计其中的碳水化合物， 所 得apoBl 00 的 分子量为 4 9 6 820+2 484 kD，该 结果与用 cDNA 推导出的人 apoBl 00 的氨基酸序列的结果 512937 kD 十分接 近。 人血浆 LDL 含有 80 的脂质和 20的蛋白质。apo B 是其 惟一的蛋白成分，它是一种糖

10、蛋白，其中糖的含量占 410 ，它们是半乳糖、甘露糖、N 一乙酰胺基葡萄糖和唾液酸。也有人认为 apo B 的糖含量为 810、 甘露糖占 4.8、半乳糖为 2.1、唾 液酸为 1.7、氨 基已糖为 0.9，并分离了两种糖肽。这些碳水化合物与天门冬酰胺相连。在apo B 分子中 有 1 9 个潜 在的 N 连 接 的糖基化位置。Weisgraber 和 Rall指出，在 apoBl 00分子中有 7个不同位置可与肝素紧密结合。 apoBl 00 有高度的免 疫原性， 将 LDL 注射给家 兔可产生高滴度的抗体， 用纯化的 B1 00和 B48 免疫 家兔所形成的多克隆抗体有交叉反应，说明两种

11、apoB 含 有 共同的抗原决定簇。Marcel 等已 用这些抗体制出在 apoBl 00、 B48、B7 4和 B8 6的特异抗原决定簇。这些结果说明 B48 序 列包含在 B100 中。Young 等采用一种特异性克隆抗体 M1 9 鉴 定 了 2 3 例 人的抗体，发现 B1 00 中的一种 共同的基因多态性，并显示它们有同一 MBl 9多态性存在于 BI 00和 B48 中。 这些结果为 B1 00和 B48是同一基因的产物提供了有力的依据。 (二)apoBl00 cDNA 和氨基 酸序列 1986 年 有数个实验室几乎同时克隆出人和大鼠的 apoBl00的 cDNA。 一般鉴定 cD

12、NA 克隆用两种方法：用寡聚核苷酸探针与核酸杂交，该探针系从已知的 apoB 肽的氨基酸序列推导出核苷酸序列；从不同表达的载体中部分克隆的 cDNAs 中以免疫方法鉴定类似 apoB 的特异产物。 Chan等人采用 gtll 为 表 达载体和多克隆及单克隆抗体， 最初 克隆了相当于 apoB的 cDNA 羧端 部分的 30 个 cDNA 克隆。 进一步对 30个克隆核甘酸序列进行了测定， 最后拼接出 apoBl 00的全部序列，包括 1 4 0 70 bp 和 polyA。全序列 包括 5非翻 译区 78bp、 1 3 689 bp 编码 区和 3一端 的非翻译区 303 bp。1 个 多腺核

13、苷化的信号(poly-ad enylation signal)肽， AATAAA 区 位 于 polyA 尾 巴上游的 22 bp 处 。 apoBl 00 的 mRNA 是目前知道的 真核生物(eukaryote)最大 的 mRNA 之一 。 apoBl 00 分子含有 4 5 6 3 个 氨 基酸，其中 2 7 个氨基酸 为信号肽，4 5 6 3 个为 成 熟的蛋白。其中 2 3 6 6 个 氨基酸残基已用直接分析 apoBl 00肽的方法加以证实。因此 apoBl 00 是已知的 最大的单体蛋白质。它具有很高的疏水性，平均为 O9 1 3 kcal残 基，比其他载脂蛋白为高。 apoE、

14、 apoIV、 apoAI、 apoA 、 apoCI、 apoC、 apoC分别为 O 7 1 8、O7 7 2、 O 806、O 8 6 3、 O8 2 5、 O8 38和 O7 5 2 kcal残基 。 此外发 现在 apoB分 子中有少量但在统计学上有意义的内部重复的氨基酸区域。 apoBl 00的 cDNA 含有 1 4 1 2 1 个 核苷核，在 5和 3一端 的非翻译区分别为 1 28和 304 bp。 apoB cDNA 编码的 2 7 个疏水性 氨基酸的信号肽在翻译时已断裂。Boerw einkle 和 Chan 均证 实在2apoB 的信号 肽存在 3 个 氨基酸的插入或缺

15、失的多态性， 但后者不具备功能上的重要性。 apoB肽链的特点之一是序列内部有高度的重复序列区， 并与其他载脂蛋白序列有同源性， 它们大都存在于可能形成双性螺旋的地方。 (三 )载脂 蛋 白 B100 在 代谢中的作用 概括起来 apoBl00 有以下四种 主要功能： 合成、装 配和分泌三 酰甘油丰富 的脂蛋 白VLDL ； 它可与脂质结合， 是 VLDL 的结构蛋白； 与肝素及不同的糖蛋白结合， 参与 LDL 与动脉粥样斑块的相互作用；与 LDL 受体结合 ，调节 LDL 从血浆中的清除。 1apoBl00 与脂质的 亲和作用 apoB1 00 的整 个肽链结构中含有许多疏水区。此外，在此区

16、域还发现有 9 个双螺旋结构，每个双螺旋结构有 22 个氨基酸组成，它们的性质与其他载脂蛋白中结合脂质的双性螺旋性质相似。 在 apoBl00 序列 中能形成双性螺旋结构的序列大多集中在 apoBl00 分 子的羧基端。ApoBl 00 还含有多个脯氨酸丰富序列，预计这些序列是用于形成-片层和 -转角的。他 们分布于除 N-末端的 1000 个氨基酸之外的整个 apoBl 00 序列上。 虽然双性-片层不存在于其他的载脂蛋白， 该结构也与脂质有高度的结合潜力。因此在 apoBl OO 整个分子 中有许多能与脂质的结合区， 这一结果可以很好的解释 apoB不 会在脂蛋白分子之间进行相互转换的原因

17、。其他载脂蛋白的序列中仅有 12 个脂质结合区，很容易在脂蛋白之间进行交换。 如果 apoBl00的整个序列都对脂蛋白结合十分重要， 那么可以预料缩短的 apoB1 00 分子应该可 以形成更致密的脂质贫乏的颗粒。 Young 和 Grabam 等均指 出，缩短的 apoB 异构体结 合比较少的脂，Young 还 发现，缩短的apoB 所含氨 基酸为 2046(apoB48)存在 于 VLDL 和 LDL ；另一缩 短的 apoB3 7 含 1 7 28个 氨基酸，存在于密度小于 1006 gml 部分中，但大部分存在于血浆 HDL 部分；另一缩短的apoB3 1 含 1425 个氨基酸 ，仅

18、存在于 HDL 的亚类和 密度大于 1.21g ml 部分 中。上述实验结果表明 apoB 蛋白愈短， 产生的分子颗粒愈重和脂质含量愈贫乏。 发现 apoB3 7， 而非 apoB3 1 存在于 VLDL 部分，提 示 apoB 的 第 1 4 2 5 至 1 7 2 8 氨基酸序列之间可能具有形成富含三酰甘油的 VLDL 颗粒 的关键区域。 2apoBl00 氨基酸序列 片段与功能的关系 Yang 等人对人 apoBl 00 如何 分布于 LDL 分子上做出了 重要贡献。 他们用胰酶 测定 LDL 分 子上哪些序 列可以被胰 酶水解，哪 些不被 水解。 胰酶可以释放的称之为 TR 肽， 不

19、被胰酶释放的称之为 TN肽。 有些肽段既含有 TR 也 含 TN部分，则称之为 MX 肽。他们总共测定出 apoBl 00 分 子 88 的氨基酸序列，按照可以被胰蛋白酶释放和不能释放的情况，他们将 LDL 分 子上 apoBl 00 的序列划分为 5 个区域：1 区第 11 000 个氨基酸段主要为 TR 肽 ； 2 区 第 1 00 1 1 7 00 个氨基酸段 含 TR 和 TN 肽 ，称之为 MX 区 域；3 区第 1 70 13 0 7 0 个氨基酸 主要含 TN 肽 ，但也有 TR 肽；4 区第 3 0 7 1 4 1 00 个氨基酸， 主要为 TR 和 MX 肽 ； 5 区 第

20、4 1 0 1 4 5 3 6 个 氨 基酸，几乎 完全是 TN 肽。一般来说，疏水性愈强的区域，则愈不易被胰蛋白酶释放。控制胰蛋白酶释放和不释放 apoB 分子中的肽 段的因素尚不完全清楚，不能简单地说能释放 TR 的肽是位于 LDL 分子的 表面， 而不能释放的片段则位于 LDL中心。 无论如何上述解释还是有一定道理的。特别是最近 Yang 等纯化并 测出 1 3 个 apoBl 00 胰蛋 白酶可释放肽的序列，后者可与三种磷脂发生自发性的结合。所有这些肽段都是高度疏水性的，未发现双螺旋结构或者多肽链。其中五种是表面上的，胰酶可水解到的部分是位于整个 apoB 分子表面的多肽链，其余为核心

21、肽，是胰酶水解不到的，它们大部分群集于 apoBl 00 羧基 端的 3 3 个 氨基酸。此外，用电镜观察 LDL 的表面， 他 们所得结果证实了 apoBl 00 的确环绕 着 LDL 分子 。 最近发明了一种新的电镜技术，可以观察到 LDL 分子上的 apoBl 00，直接 看到 apo B 和特异的单克隆抗体在 LDL 分 子上的结合位置。这工作使我们对 apo B 在 LDL 分子上的相对位置有了更清楚的了解。 3apoBl00 结 合 LDL 受 体的机制 a poBl 00 的 羧基端是与 LDL 受体结合 的区域。最3近 Milne 等 对 apoBl 00 与受体结合的机制进行

22、了比较详细地研究。他们使用了 apoBl00 的30 种单克隆 特异性抗体， 观察哪些单克隆抗体可以抑制 LDL 与 LDL 受体 的结合。 他们发现，结合位于 LDL 第 2 9 803 7 80 位氨基 酸之间的抗体可以完全阻止 LDL 与 LDL 受体的结 合 。结合在此区域两侧的抗体仅可以部分地阻止 LDL 与 LDL 受体 的结合。但是，单克隆抗体与LDL 分子其 他位置上的结合则无阻止作用。其他实验也显示 apoBl 00 分子的羧基端有 LDL 与受体结合的作用。 首先， 短缺羧基端的 apoB 不能 与 LDL 受体 结合。 其次， Milne 等 对 apoB 的羧基端的研究

23、发现， 它们可能含有三种不同的肝素结合区， 后者具有一簇簇带正电荷的氨基酸。Yang 等提出具有这些氨基酸的肽段，而不是 apoB 的 其他区域的肽段，才可以与 LDL受体相结合。同时，还知道 apoB 含 有一簇正电荷氨基酸的肽段在进化中被较好地保留了下来。apoB 之 所以能与 LDL 受体相结合 是因为通过 apoB 的带正电 荷区域与 LDL 受体中带负电荷的半胱氨酸的重复区域相结合的结果。 化学修饰 apoB 的 带正电荷区可阻止其与 LDL 受体的结合。 此外 apoBl 00氨基酸第 3 5 00 氨基酸的 变异即从 Arg 变 为 Gln， 这样就使 LDL 分子不能与 LDL

24、 受体结合。 以上证据充分说明 apoB分子中的羧基末端对 LDL 与 LDL 受体结合是十分重要的。 三、载脂蛋白 B 1 00 基 因在染色体中的定位、基因表达和调控 对目前 已发表的有关人 apoAI、 apoA 、apo AIV、apoCI、apoC 、apoC和 apo E及鼠的 apo AI、apo A 和 apoE 的氨 基酸和 cDNA 序列的分析，Luo 等认为 编码这些蛋白质的基因可能有一共同的祖先。 但是在进化的过程中这些基因分布于不同的染色体中： apo AI、apoC和 AIV 位于第 11 号染色体长臂上；apo A在第 1 号染色体，apoE、apoCI、 apo

25、C则在第 1 9 号染色体。而 apoBl 00 的结构基因在第 2 号染色体。用原位核酸杂交法又发现apoBl 00 基 因位于 p2 3。apoBl 00 在染色体中的位置与其他载脂蛋白的位置相距甚远。 (一 )染色体 定位 apo B 基 因 位于第 2 号 染色体 p2 3一 pter 区。 apoBl 00 基 因有下列特点，全长约 4 3 kb长，含 2 9 个外显子和 28 个内含子， 其中外显子 2 6 和 2 9 特 别长，分别含有 7 5 72 bp和 1 906 bp，外显子 2最短，仅 3 9 bp(211 24 9)，其次是 外显子 8 含 8 6 bp(9 4 71

26、 0 3 2)，其 余 2 5 个 外 显子含 1 1 63 7 4 bp不等；内含子中第 2 7个内含子为最短(107 bp)，其次分 别为内含子 2 2 和 11。内 含 子 1 3 和 1 2 分别含 2 6 3 bp 和 9 00 bp，其余 内含子含 1 0003 000 bp。内含子核苷酸数量与外显子的比例为 2 8 9 8 71 4 1 2 1 bp，内含子的长度约为外显子的 2 倍 。 外显子 2 6 编 码 1 3 79 到 3 903 氨 基酸，它比任何以往报道过的哺乳类动物的外显子长 3倍 。 apoBl 00 基因的内含 子中含有 6个重复序列， 还有 1个 AT 丰富

27、的高可变区，位于 apoB 基 因 3末端，该区由不同数目的 1 5 bp 的高变异单位组成，人群中至少有 1 4 种不同的 3末端高可变等位基因。最近，在 apoB 基因的内 含子20 中鉴定出 另一个串联的重复序列，它具有 3种常见的等位基因。 (二 )apoB 基 因变异与不同 LDL 抗原 系统的关系 早在克 隆和顺序分析 apoB 的 cDNA 以前已有 证据说明，apoB 是一种多 态的蛋白质。20世纪 6 O 年 代早期已观察到在多次输血的地中海贫血患者的血清中存在抗体可与人 LDL 反应。 家族研究显示与这些抗体可以结合的抗原存在于一些个体的血清中而不存在于另一些个体中，而且抗

28、原的存在是以简单的曼德勒方式继承为特点的。到 1 9 7 4 年已发现 5种不同的 LDL 抗原 对 (antithet tical)， 即 Ag(x y)、 Ag(a1 d)、 Ag(cg )、 Ag (t z)和 Ag(hi)。有了 克隆 apoB cDNA 技术，家 族研究显示 Ag 多态性之一与经常在 apo B 基因中出 现的限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)有很强的 连锁不平衡，从而认为，apoB 的Ag 多 态性是由于 apoB 基因遗传结构发生变异的结果。基于 5 对抗原的不同组合，显然可以产生许多不同抗原 的表型。用 这种抗血清 完全可以证 实在人群中 存在着很多 不同的

29、 LDL 表型。 大量的 LDL 表 型至少是由 1 5 种不同的 LDL(或 apoB)单倍体而引起。不同 LDL 表型的频率 在4不同种族的人群中也不相同。 近年来 ，一些研究者的结果表明原来被人多克隆抗体识别的几种 Ag，现在也可 被鼠 类的单克隆抗体所识别，Young 等 揭示，单克隆抗体 M1 9 可以鉴别出两种普通等位基因多态性；它们可与 apoB 异 原型(all0 types)MB1 91和 MB1 92 结 合，前者的亲和力强，后者 较弱。 随后发现用 MBl 9 检 出 的多态性与 Ag(cg)完全 一致， 单抗 MBl 9 对测定 由突变的 apoB等位基因所产生的异原型

30、 apoB 的浓 度是一种很有用的试剂。此外，免疫亲和层析技术从血清中分离 MBl 9 杂合子异 原型的 apoB，使用 MBl 9 抗体为配基也是很有用的方法。最近，大鼠的单克隆(H l163)经制备和鉴定，可用来检出 Ag(h i)抗原对(antigen pair)。 用 apoB cDNA和基因克隆技术已积累不少数据，显示 apoB 基 因的不均一性，Ludwig 等已经发现了 7 5 个位点有 不同的核苷酸。 这些不同有些是由于测定 DNA 顺 序过程中出现的错误所造成， 但其中 1 2 个 序列的不同已分别被数个实验室加以证实， 因此他们认为这些代表了真正的 apoB 基因核苷酸序列

31、的多态性。其中有十个序列的变化发生了氨基酸替换。有些氨基酸的替换与 Ag 类型 相符合，很容易检出，因为它变更了 apoB 限制 性内切酶的位点。 载脂蛋白 B 48 一、小肠载脂蛋白 B48的发现 1 978 年 和 1 980 年 Krishnaiah 等 人首先鉴定到小肠的 apoB。他们发现 在大鼠被饲 喂高脂和高胆固醇食物之后， 在血浆 VLDL 、 LDL 以及淋巴液 的脂蛋白中存在有 apoB类蛋白质。在 SDS-PAGE 电泳中， 这一类蛋白质比来源于肝脏的 LDL 的 apoB 分子 量小。这两种形式的 apoB 表 现出共同的抗原性， 具有相似的氨基酸组成。 1980 年，

32、 Kane 等人发现在 人的乳糜微粒中有肠源性 apoB 类蛋白，在其他密度范围中没有发现。他们还发现肠源性和肝源性apoB 的氨基 酸组成有明显的差距。在 SDS-PAGE 电泳分离时，肠源性 apoB 的分子量仅相当于肝源性 apoB 的 48， 由于不同的实验室测得的分子量极不统一，所以 Kane 等人 假定了百分制命名制， 把大的 apoB命 名为 apoBl00， 小的 apoB命名为 apoB48(apolipoproteinB48)。后来，这一 命名被脂蛋 白研究领域 中的大多数 研究者所接 受，不仅是 对人的 apoB，而且 对所有动物的 apoB 也是这样 命名的。 大鼠的

33、肝脏既能合成和分泌 apoBl 00，也能 合成和分泌 apoB4 8。但是 ，在大鼠的小肠中仅能合成 apoB4 8。人血 浆 CM 和小肠 CaCo-2 细胞 中也存在肠源性 apoBl 00，但必须在 采血几个小时内尽快分析乳糜微粒样品才能发现 apoB4 8 的 存 在 。 如果在取血 12d 以 后再进行分析，只能发现比 apoBl 00 小的蛋 白质色带以及类似于 apoB4 8 的蛋白 质的色带。这表明肠源性的 apoBl 00 对蛋 白酶水解是非常敏感的，并可能逆转为小分子量的 apoB48。 人胎儿 小肠可以合成 apoBl 00，但在发育、成熟过程中，它的合成逐渐减少。Ho

34、eg 等也证明，成人小肠也可以合成和分泌 apoBl 00和 apoB48。 甚至无一脂蛋白血症的患者也能在局部合成 apoBl 00和 apoB48， 但是它们不能分泌这两种蛋白质。人和大鼠的小肠除能合成和分泌 apoB48 以外， 也能合成和分泌 apoBl00，同时证明，肠源性 apoBl 00 在体外 还能降解为较小的 apoB 分 子。 根据 apoBl 00 cDNA 的研究结果，证明 apoBl 00 基因存在 于人、猴和大鼠的肝脏和小肠中，这表明 apoBl 00在小肠中的合成与在肝脏中的合成是一样的。然而，apoB48 的合成是由于 apoB mRNA 在小肠 中出现了一个终

35、止密码子，即编码 Gln 的密码 子 CAA，其中的 C 被U 取代产生了 UAA 这一 终止密码子，由此而产生了只具有 2152 个氨基酸 的 apoB48， 其羧基末端是异亮氨酸。由此证明，apoB48 是小肠中主 要的存在形式。 apo B48 是正 常人血清的载脂蛋白之一，它的分子量恰好是 apoB l00 的 48而得名。Apo B48 是 组 装小肠 CM 所 必需的，许多研究揭示，CM 中只有 一个分子的 apoB48。它在 代谢过程中一直存留在 CM 中，而不与其他脂蛋白分子交换。一些实验室正在研究正常人的肠细胞是否偶尔也可合成 apoBl 00，而不 仅合成 apoB48。十

36、二指肠 可合成大量的 apoB48， 而不5合成 B1 00。CM 从小肠 细胞分泌后进入淋巴液，并通过胸导管再进入血液循环，CM 分布在毛细血管的内皮细胞，主要是骨骼肌和脂肪组织的内皮细胞，在这些地方 CM 中 809 O三酰甘油被脂蛋白脂肪酶水解。 剩下的脂蛋白颗粒则称之为 CM 残粒， 后者被输送到肝脏，在肝脏被肝脂酶进一步分解代谢，最后被能识别 apoE 的残 粒受体摄取。至于参与摄取这些残粒是 LDL 受体， 还是 LDL 受体相关 蛋白或其他蛋白质， 目前仍在研究之中。 apoB48 不 参与肝残粒受体的相互反应。 apoB48一旦进入到肝脏， 该颗粒则被引到溶酶体并在那里消化，由

37、残粒受体来的胆固醇进行酯化并以胆固醇酯的形式蓄存， 用于胆汁酸的合成或者合成肝脂蛋白。CM 残粒基本上作为一种大的颗粒(dl.0 克升为 轻度偏高； 1.2g/L 为 明显增高。 增高常见于型高脂血症、胆汁淤积、冠心病、肾病、脑血管病、甲状腺功能低下、及银屑病。 降低：常见于肝功能损害的实质性病变、甲状腺功能亢进、低脂蛋白血症。 另外 AapoB基因的异常也可以导致一系列疾病的产生。 比如无脂蛋白血症、 低脂蛋白血症可能为 AapoB 基因突变，导致 AapoB 合成障碍或产生畸变的 AapoB mRNA 或 蛋 白质分子所致。还有家族性 AapoB100缺陷，可引起高胆固醇血症。 2.蛋白质

38、的分离纯化原理一，蛋白 质 （包括酶 ） 的提取大部分蛋白质都可溶于水、 稀盐、 稀酸或碱溶液， 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的 1-5 倍 ， 提取时需要均匀的搅拌， 以利于蛋白质的溶解。 提取的温度要视有效成份性质而定。 一方面， 多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大， 因此， 温度高利于溶解， 缩短提取时间。 但另一方面， 温度升高会使蛋白质变性失活， 因此， 基于 这一点考虑提取蛋白质和酶时一

39、般采用低温 （5 度以下） 操作。 为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等） 。 下面着重讨论提取液的 pH 值和盐浓度 的选择。 1、p H 值 蛋白质， 酶是具有等电点的两性电解质， 提取液的 pH 值应 选择在偏离等电点两侧的 pH 范围内。 用稀酸或稀碱提取时， 应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化， 从而导致蛋白质构象的不可逆变化， 一般来说， 碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取， 而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，9具有保护蛋 白质不易变 性的优点

40、， 因此在提取 液中加入少 量 NaCl 等中性盐，一 般以 0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用 0.02-0.05M 磷 酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶， 不溶于水、 稀盐溶液、稀酸或稀碱中， 可用乙醇、 丙酮和丁醇等有机溶剂， 它们具的一定的亲水性， 还有较强的 亲脂性、 是理想的提脂蛋白的提取液。 但必须在低温下操作。 丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越， 一是因为丁醇亲脂性强， 特别是溶解磷脂的能力强； 二是丁醇兼具亲水性， 在溶解度范围内 （度为 10%， 40 度为 6.6%） 不会引

41、起酶的变性失活。 另外，丁醇提取法的 pH 及温度 选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白 质 的分离纯 化蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的 盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响， 一般在低盐浓度下随着盐浓度升高， 蛋白质的溶解度增加， 此称盐溶； 当盐浓度继续升高时， 蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出， 这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的 SO4 和 NH4)有很强的水化力， 可夺取蛋白质分子的水化层， 使之“失水”， 于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则

42、效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同， 故盐析所需的盐浓度也不一样， 因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有： （1） 温度： 除对温度敏感的蛋白质在低温 （4 度） 操作外， 一般可在室温中进行。 一般温度低蛋白质溶介度降低。 但有的蛋白质 （如血红蛋白、 肌红蛋白、 清蛋白）在较高的温度（25 度）比 0 度 时溶解度低，更容易盐析。 （2） pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。 （3） 蛋白质浓度： 蛋白质浓度高时， 欲分离的蛋白质常常夹杂 着其他蛋白 质地一起沉 淀出来（共 沉现象） 。因 此在盐析前 血清要加

43、等 量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 2.5-3.0%。 蛋白质盐析 常用的中性 盐，主要有 硫酸铵、硫 酸镁、硫酸 钠、氯化钠 、磷酸钠等 。 其中应用最多的硫酸铵， 它的优点是温度系数小而溶解度大 （25 度时饱和溶 液为 4.1M， 即 767克/升；0 度 时饱和溶解度为 3.9M， 即 676 克 /升 ） ，在这一溶 解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来； 另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好， 不易引起蛋白质变性。 硫酸铵溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之 间 ，当用其他 pH 值进行盐析 时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后， 需要将蛋白质中的盐除去， 常用的

44、办法是透析， 即把蛋白质溶液装入 秀析袋内（ 常用的是玻 璃纸） ，用缓 冲液进行透 析，并不断 的更换缓冲 液，因透析所需时间较长， 所以最好在低温中进行。 此外也可用葡萄糖凝胶 G-25 或 G-50 过柱的 办法除盐，所用的时间就比较短。 2、等电点沉 淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小， 因而溶解度也最小， 各种蛋白质的等电点有差别， 可利用调节溶液的 pH 达到 某一蛋白质的等电点使之沉淀， 但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3、低温有机 溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂， 甲醇， 乙醇或丙酮， 可使多数蛋白质溶解度降低并析出， 此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超 滤 10